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荧光显微镜的原理

2020-05-21 |  来源:本网原创
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荧光显微镜是利用细胞内物质发射的荧光强度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。今天来介绍一下荧光显微镜的原理

    荧光显微镜的原理

荧光显微镜

    荧光显微镜是利用细胞内物质发射的荧光强度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。细胞内的荧光物质物质有两类,一类直接经紫外线照射后即可发荧光,如叶绿素等;另有一些物质本身不具这一性质,但如果以特定的荧光染料或荧光抗体染色,经紫外线照射后亦可发荧光。


    荧光显微镜的原理为利用一个高发光效率的点光源(如超高压汞灯),经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650λ或紫蓝光4200λ)作为激发光,激发标本内的荧光物质发射出各色的荧光后,再通过物镜后面的阻断(或压制)滤光片的过滤,最后经由目镜的放大作用加以观察。阻断滤光片的作用有二:一是吸收和阻挡激发光进入目镜以免干扰荧光和损伤眼睛;二是选择并让特定的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。


    荧光显微镜按照光路原理可分为两种:

    1.透射式荧光显微镜较为旧式的荧光显微镜,其激发光源通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱。所以它仅适用于观察较大的标本材料。


    2.落射式荧光显微镜激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜


    光路中需加上一个双色束分离器(分色镜),它与光轴呈45o角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,返回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块,可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。


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